UROCULTIVO



1- Objetivo


Realizaremos un urocultivo para la determinación de los diferentes tipos de microorganismos presentes en dos muestras de orina. Realizando las diferentes pruebas para el diagnostico de las posibles enfermedades o infecciones urinarias.



2- FUNDAMENTO


El urocultivo se basa en la identificación del número y de los tipos de bacterias presentes en la orina. Es necesario que el método de recogida sea el adecuado siguiendo unos protocolos de higiene evitando así posibles contaminaciones de la muestra.
Para la identificación del número de bacterias, realizaremos un recuento bacteriano (Hygicult TPC) y para la identificación de los tipos de bacterias presentes en la orina y sus patologias, se realizara una siembra en medios de cultivo diferentes con la técnica de siembra comúnmente utilizado en el urocultivo, según el tipo de microorganismo comúnmente encontrado en la muestra.

Los diferentes cultivos que vamos a utilizar serán:

· CLED, Agar: Es un medio de cultivo diferencial para aislar y contar las bacterias presentes en la orina. También se utiliza para la diferenciación de bacterias fermentadoras de la lactosa o las no fermentadoras. Es comúnmente utilizado para el crecimiento de enterobacterias y bacilos Gram – presentes en las orinas patológicas.
· CPS3: se utiliza para el aislamiento, recuento e identificación directa de Escherichia coli, Proteus y Enterococcus.
· CNA: es un medio selectivo para el aislamiento y permite el crecimiento de bacterias Gram positivas, aunque en ocasiones puede haber crecimiento de alguna Gram negativas.
· Agar nutritivo: medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus requerimientos nutricionales. No contiene inhibidores del desarrollo bacteriano. En nuestro caso será utilizado para el cultivo de Cándida albicans y Streptococcus.
Por otro lado utilizaremos el kit Urin system, panel utilizado para el contaje, identificación presuntiva y susceptibilidad antibiótica de microorganismos presentes en infecciones urinarias. Este consta de 24 pocillos los cuales se dividen en 2 pocillos para el recuento, 7 pocillos de cultivo para la identificación y 15 para las pruebas de sensibilidad (antibiograma).
También se realizará un examen macroscópico y microscópico de la muestra y del cultivo. En el examen macroscópico de la muestra se deberá observar el color, olor, la densidad, turbidez, volumen, la química seca (tiras reactivas) y el diagnostico del pH y el examen microscópico en fresco de la orina. En el examen macroscópico del cultivo ha de visualizarse la forma, color, forma de sus bordes y la superficie de las colonias. Y en el examen microscópico del cultivo la diferenciación de las bacterias Gram positivas de gram negativas y las diferentes formas que presenten (coco, bacilo, estafilococos…)





3- Materiales


· Asas de siembra desechables
· Portaobjetos
· Placas de Petri
· Mechero
· Pinzas
· Papel platina
· Papel de filtro
· Vasos de muestra
· Pipeta
· Microscopio
· Tubos de ensayo
· Gradilla
· Jeringa
· Suero fisiológico

Reactivos
· Urin system plus (kit de recuento, identificación y sensibilidad)
· Hygicult tpc (recuento)
· Tiras reactivas
· Kit de gram
Medios de cultivo
· CLED Agar, CNA, Agar nutritivo, CPS3.
Muestra
· Muestra 1
· Muestra 2





4- PROCEDIMIENTO:


Recogida de muestra:
Se utilizará un recipiente de muestra desechable. La orina que se recogerá será la primera orina de la mañana, por ser una orina más concentrada.
Para su recogida se lavara cuidadosamente la zona genital, con agua y jabón y se secara con una gasa estéril o una toalla limpia. Hay que recoger la porción de orina que corresponda a la mitad de la micción, desechando la porción inicial y final de la micción y recogiendo el resto en el frasco estéril. Por último se tapa bien el frasco y se procederá a su análisis.

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Análisis de la muestra:
Ante todo realizaremos los siguientes medos de cultivo: Cled agar, CPS3 y CNA, y mientras se van auto clavando procederemos a la observación macroscópica de la muestra, para ello observaremos el volumen, la densidad, la turbidez, mediremos el PH y utilizaremos las tiras reactivas para conocer si existe presencia de sangre, de nitritos, de cetonas, de acido ascórbico, también para conocer la cantidad de proteínas y de leucocitos.
Para realizar esta prueba vamos a introducir la tira reactiva dentro del recipiente con la ayuda de unas pinzas. Luego la tira la depositaremos sobre un papel de filtro y procederemos rápidamente a su lectura, comparando los colores con los del bote.
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Después vamos a realizar un examen microscópico. Para ello vamos a utilizar la técnica de la tinción de Gram para conocer la presencia de bacterias Gram + y Gram-.
Una vez se hallan autoclavado los medios, los dejaremos solidificar y realizaremos la siembra con asas desechables en los correspondientes medios de cultivo. Luego los rotulamos con la fecha y el número de la muestra (en este caso 1 ó 2) y los incubamos a 37ºC durante 24 horas.
Por otra parte utilizaremos la técnica hygicult tpc para obtener el recuento de bacterias que aproximadamente hay en la orina, para ello, impregnamos el cultivo específico, colocado en forma de gel, dentro de la muestra y lo ponemos a cultivar de 18-24 horas.
La otra prueba que realizaremos será la URIN SYSTEM PLUS que consiste en realizar dos suspensiones. Una suspensión A (donde cogeremos 0’5ml de muestra con una pipeta y 1´5ml de suero salino) y otra B (donde tomaremos 0’2ml de la suspensión A mas suero médium del kit). Procedemos a añadir a cada pocillo 0’2ml con la pipeta de las dos suspensiones hasta los pocillos 9 con la suspensión A y el resto con la suspensión B. Ponemos a cultivar 24 horas y leemos resultados.
Pasadas las 24 horas observaremos el crecimiento obtenido:
Con respecto a los medios de cultivo de cada muestra, realizaremos un examen macroscópico de las colonias, observando sus bordes, sus tamaños, su forma y su superficie.
Con lo observado anteriormente iremos buscando posibles microorganismos teniendo siempre en cuenta las características de los medios. Luego haremos la tinción de Gram para comparar y descartar las cuestiones antes analizadas.
Realizaremos un inoculo por cada muestra, luego realizaremos las extensiones necesarias y teñiremos con Gram. Por último observamos al microscopio y copiamos los resultados para luego compararlos con los posibles resultados de las colonias observadas.
Con respecto a la lectura de la técnica hygicult TPC utilizaremos unas pinzas para sujetar los geles de cultivo y colocarlos en un portaobjetos, para así observar mejor el crecimiento y apuntar los resultados obtenidos de la concentración bacteriana.
En cuanto a la los resultados de la prueba URIN SYSTEM PLUS observamos los cambios de colores y anotamos la presencia de microorganismos comparando con la hoja de resultados que posee el kit.





5- Resultados


Examen macroscópico de la orina

Muestra 1:presenta un olor característico a café. Con un color amarillento fuerte y con presencia de sedimentos en el fondo del recipiente. Con una densidad normal y una ligera turbidez. El pH que obtuvimos ha sido 7.5. El resultado de las tiras reactivas ha sido el siguiente: bilirrubina negativa, Urobilinógeno normal, cetonas normal, ácido ascórbico negativo, glucosa normal, proteínas negativo, sangre negativo, pH 7.5, nitritos negativo, leucocitos negativo y una densidad de 1,015.

Muestra 2:presenta un olor característico, con un color amarillo claro, sin presencia de sedimentos ni turbidez con una densidad normal. El pH ha sido 5. El resultado de las tiras reactivas ha sido: bilirrubina negativa, Urobilinógeno normal, cetonas normal, ácido ascórbico negativo, glucosa normal, proteínas negativo, sangre negativo, pH 5, nitritos positivos, leucocitos negativo y una densidad de 1,020.

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Examen microscópico de la orina en fresco

Muestra 1:presencia de cocos, bacilos, células epiteliales.
Muestra 2:presencia de cocos, bacilos, células epiteliales y cristales.

Examen macroscópico de los medios de cultivo

Muestra 1:
- Cled agar: presencia de colonias de color amarillo, de tamaño grande, con bordes circulares y superficie convexa.


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- CPS3: presencia de diferentes colonias:

o Colonias de color marrón oscuro, de grandes tamaño y medianas, bordes circulares, superficie elevada y se encuentran en gran cantidad.
o Colonias de color verde, de pequeños tamaños, bordes circulares, se encuentra en poca cantidad.
o Colonias blancuzcas, de diminuto tamaño, céricas y brillantes.
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- CNA: presencia de dos tipos de colonias:

o Colonias con halo: las colonias son de color blanco, mientras que el halo es amarillento, su forma es circular, sus bordes regulares y presentan superficie cóncava.
o Colonias sin halo: forma circular y bordes regulares.
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- Agar nutritivo: observación de dos tipos de colonias.

o Colonias de color blanco: de pequeño tamaño, brillantes, redondeadas.
o Colonias de color naranjadas: con bordes redondeados y de tamaño normal.

Muestra 2:
- Cled agar: presencia de colonias de color amarillo, con bordes circulares y presentes en poca cantidad.

- CPS3: presencia de diferentes colonias:

o Colonias de color verde, de grandes tamaño, bordes circulares y están presentes en mayor proporción
o Colonias de color blanco, de pequeños tamaños,

- CNA: presencia de dos tipos de colonias:

o Colonias con halo: las colonias son blancas y sus halos amarillos, tienen forma circular, sus bordes son regulares y tienen una superficie elevada.
o Colonias sin halo: son de color blanco, su forma es circular.

Examen microscópico de los medios de cultivo
Muestra 1: tinción de gram, observación por colonias y medios.
- Cled agar:
Colonias amarillas: E.coli se observan bacilos cortos de color rosa (presenta una leve acidificación del medio, estando este de color amarillo) y Enterococcus se observan diplococos gram positivos.
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- CPS3:
Colonias marrones: E.coli, bacilos cortos gram negativos, se observan de color rosados.
Colonias verdes: Enterococci, con forma cocobacilar de color rosa.
Colonias blancas: Candida albicans, son levaduras, se observan con presencia de algunas esporas, hifas.
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- CNA:
Colonias blancas: E.coli, se observan bacilos cortos de color rosa.
Colonias blancas con halos: P.vulgaris, bacilos de color rosa y con pilis.
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- Agar nutritivo:

Streptococcus: de color azul.


Muestra 2: tinción de gram, observación por colonias y medios.

- Cled agar:
Colonias amarillas: E.coli se observan bacilos cortos de color rosa (presenta una leve acidificación del medio, estando este de color amarillo) y Enterococcus se observan diplococos gram positivos.
- CPS3:
Colonias marrones: E.coli, bacilos cortos gram negativos, se observan de color rosados.
Colonias verdes: Enterococci, con forma cocobacilar de color rosa.
Colonias blancas: Candida albicans, son levaduras, se observan con presencia de algunas esporas, hifas.
- CNA:
Colonias blancas: E.coli, se observan bacilos cortos de color rosa.
Colonias blancas con halos: P.vulgaris, bacilos de color rosa y con pilis.
- Agar nutritivo:
Presencia de Streptococcus, bacilos cortos, diplococos, cocos, cocobacilos.


Resultados de la técnica hygicult tpc
En la muestra 1 obtuvimos una concentración bacteriana de 106 bact/ml y en la muestra 2 la concentración bacteriana obtenida fue de 105 bact/ml.
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Resultados de la prueba URIN SYSTEM PLUS

Muestra 1:
Bacteriuria: CFU/ml > 106
E.coli: positivo
Proteus: positivo
Pseudomonas spp: negativo
Klebsiella: negativo
Enterococcus spp: positivo
Staphylococcus spp: negativo
Candida albicans: positivo
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD (ANTIBIOGRAMA)
No es susceptible a TZP, FOS, AMS, AUG y C.
Resistente frente a CAZ y SXT.
No han sido concluyentes: AK, CN, TOB, CFP, CTX, NA, CIP, LEV.

Muestra 2:

Bacteriuria: CFU/ml > 105
E.coli: positivo
Proteus: positivo
Pseudomonas spp: negativo
Klebsiella: negativo
Enterococcus spp: positivo
Staphylococcus spp: negativo
Candida albicans: positivo
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD (ANTIBIOGRAMA)
No es susceptible a TZP, FOS, AMS, AUG y C.
Resistente frente a CAZ y SXT.
No han sido concluyentes: AK, CN, TOB, CFP, CTX, NA, CIP, LEV.
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6- Conclusión

Cada una de las anteriores pruebas han sido realizadas con un propósito y para corroborar que nuestras sospechas tras la observación del cultivo es cierta. Para ello tras la observación de la siembra y el cultivo, al observar las colonias, decidimos realizas las observaciones microscópicas con la elaboración de la tinción de gram, para verificar que, cada una de esas colonias se corresponde con la forma que debe de presentar cada bacteria de estas.
Tras la realización de cada una de las pruebas nombradas con anterioridad durante todo el desarrollo hemos podido llegar a la conclusión que, ambas muestra presentan E.coli y Proteus vulgaris, Enterococcus, Streptococcus y Candida albicans. Ambas muestras poseen un alto número de bacterias, presentan una alta bacteriuria. En la química seca poseen unos valores normales.