PROCESAMIENTO DE UN EXUDADO FARINGEO



1. OBJETIVO


Identificar los microorganismos presentes en la muestra problema (exudado faríngeo).



2. FUNDAMENTO


El sistema respiratorio se divide en vías altas o superiores, que comprenden las áreas anteriores a la laringe, incluyendo la nasofaringe, orofaringe, laringe, epiglotis, oído externo y medio, y los senos paranásales, y vías bajas o inferiores que incluyen todas las estructuras posteriores a la laringe.

El tracto respiratorio habitual (la faringe) está formado por distintos microorganismos entre los que destacan los siguientes grupos y especies: estreptococos, estafilococos, micrococos, neisserias, Moraxella catarrhalis, corinebacterias, Haemophilus spp, Porphyromonas, Prevotella, Fusobacterium, Veillonela, Peptostreptococcus, Actinomyces, etc. Sin embargo, cuando encontramos una patología en la faringe, el agente etiológico más frecuentemente aislado es el Streptococcus pyogenes, pero también, otros microorganismos patógenos que podemos hallar son: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus alfa-hemolítico grupo viridans, etc.

Para poder identificar el agente microbiano de la muestra problema, se procederá a la siembra del mismo en diferentes medios de cultivo, y así observar si hay o no crecimiento en cada uno de ellos. Además se procederá a realizar diferentes pruebas, como la tinción de Gram, la catalasa….
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3. MATERIALES UTILIZADOS


· Hisopo/medio de transporte Stuartstuartxm5.jpg
· Materiales para la realización de un medio de cultivo (matraz erlenmeyer, varilla…)
· Materiales para realizar una tinción de Gram (portaobjetos, pipeta Pasteur…)
· Tira oxidasa
· Peróxido de hidrógeno (catalas)
· Microscopio
· Autoclave
· Campana de anaerobiosis
· Guantes
· Bata
. Papel de Filtro



4. PROCEDIMIENTO


Una vez obtenida la muestra, exudado faríngeo, se procederá a la identificación de los microorganismos que posiblemente estén presentes en la misma. Para ello se realizarán las pruebas que a continuación se describen:

· En primer lugar se escogerán los medios específicos para la muestra de exudado faríngeo:
- Estreptococos β-hemolíticos; Columbia ANC + 5% sangre de cordero – agar.
- Haemophilus; Chocolate Poly Vitex Bacitracina – Agar.
- Cándida albicans, levaduras; Sabouraud Gentamicina Cloranfenicol – agar.
- Pneumococos; Columbia ANC + 5% sangre de cordeno – agar.
- Staphylococcus aureus; Chapman – medio.

No se ha utilizado el medio Loeffler, puesto que en el laboratorio no se disponía de él; no obstante, es un medio específico para el microorganismo Corynebacterium diphteriae el cual es muy improbable que no se hallara en la muestra.
A continuación se procede a sembrar cada uno de los medios por la técnica de los cuatro cuadrantes, y así obtener un mejor aislamiento de las colonias.
  • El primer día se incubaron todos los medios en aerobiosis, excepto el de agar sangre, que se incubó dentro de una campana de anaerobiosis. Para crear dicho ambiente de anaerobiosis, se introdujo en la campana un sobre que tiene como función quelar el oxígeno disponible, tanto en el espacio interno de la campana como en el de la placa. Para comprobar que estas condiciones anaeróbicas se han dado, se introdujo también dentro de la campana una tira, la cual en un principio es de color azul, y tras el periodo de incubación, si efectivamente se han dado dichas condiciones, esa coloración cambiará a transparente. La incubación tuvo una duración de 24 horas a 37⁰C.
El segundo día, todos los medios que anteriormente fueron incubados en aerobiosis, se incubaron en anaerobiosis como ya se explicó en el párrafo anterior. Además se sembró otra placa de agar sangre, pero esta vez se incubó en aerobiosis. Esta segunda incubación tuvo una duración de 24 horas a 37⁰C.
  • En segundo lugar, se realizó la visualización macroscópica a las placas en las que se produjo crecimiento bacteriano, éstas placas corresponden con las dos de agar sangre, una incubada en condiciones de aerobiosis y otra en anaerobiosis. En ambas placas se observó que las colonias tenían un halo de hemólisis correspondiente a la beta hemólisis. En un último momento se visualizaron las dos placas con la luz ultravioleta, para así diferenciar entre diferentes géneros de microorganismos.

  • En tercer lugar, se realizaron dos tinciones de Gram, una de cada placa, para así diferenciar tanto la forma, agrupación, morfología de estos microorganismos, así como las características de su pared bacteriana, Gram positivos o Gram negativos.

  • Por último, se realizaron dos pruebas bioquímicas, catalasa y oxidasa a las dos placas.

- Placa agar sangre en aerobiosis: La catalasa se realizó con el fin de diferenciar el género Streptococcus del género Staphylococcus; y, la oxidasa se realizó para confirmar el género Streptococcus.

- Placa agar sangre en anaerobiosis: la catalasa y la oxidasa se realizaron para confirmar que el microorganismo presente en esta placa es la Veillonella.



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5. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS


Visualizando las colonias obtenidas, tanto en la muestra en condiciones aeróbicas, como la muestra en condiciones anaeróbicas, podemos deducir lo siguiente:

  • En el primer caso (muestra en condiciones aeróbicas), se realizará una observación a luz natural (sin la aplicación de luz UV), en la que se ven colonias muy pequeñas de color blanco, con un halo de hemólisis alrededor, pertenecientes al grupo de los ------ hemolíticos. Posteriormente, se realiza la misma operación, pero aplicando una luz ultravioleta; en la que se observan colonias rojizas, con su halo de hemólisis amarillo-verdoso.
  • En el segundo caso (muestra en condiciones anaeróbicas), con la luz natural se observan minúsculas colonias blancas con un halo de hemólisis de color amarillas-anaranjado. Expuesta a luz UV, se observan colonias rojizas y el halo de hemólisis amarillo-verdoso.
Una vez hecho esto, a partir de una colonia aislada obtenida en el medio de cultivo agar sangre, expuesta en condiciones anaeróbicas; se ha realizado una tinción de Gram, cuyo resultado ha dado cocos, estreptococcus, estafilococcus…, Gram negativo (color rosado).

De la misma forma, se ha realizado la tinción de Gram de una colonia aislada obtenida por crecimiento en condiciones aeróbicas, en el medio agar sangre. En este caso, los microorganismos observados al microscopio han sido cocos, diplococos, tétradas, estreptococcus (observado de un tamaño mayor, que la muestra anterior), y Gram positivo (color azul).

En el resto de las placas sembradas, no ha habido crecimiento microbiano, por lo que no se ha podido realizar ningún tipo de tinción, prueba… . Esto, nos ha ayudado a descartar la presencia de algunos microorganismos.
Para poder seguir reduciendo la lista de posibles microorganismos se ha realizado la prueba de la catalasa, dando resultados negativos en ambas muestras; así como en la prueba de la oxidasa.

Según lo expuesto anteriormente, llegamos a la conclusión de que los microorganismos presentes en la muestra son:



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6. CONCLUSIÓN


Según los resultados obtenidos podemos decir que la muestra contiene microorganismos Veillonella párvula que pertenece a la flora habitual bucal. Además se ha encontrado también otro microorganismo, en este caso de origen patológico, siendo este es Streptococcus pyogenes.

Se ha llegado a la conclusión de que la muestra contiene Veillonella párvula, porque ha crecido en anaerobiosis, por la morfología presentada en la tinción de Gram, por la visualización macroscópica realizada frente a luz UV y finalmente, por las pruebas bioquímicas complementarias.
Según los resultados obtenidos podemos decir que la muestra ha sido contaminada en la toma de muestras, ya que la Veillonella es un microorganismo de la flora habitual de la boca y no de la faringe.

En el caso del Streptococcus pyógenes, hemos llegado a la conclusión que es éste microorganismo puesto que ha crecido en condiciones aeróbicas, por la morfología presentada en la tinción de Gram, y por las pruebas bioquímicas complementarias realizadas.



FOTOS DEL PROCEDIMIENTO




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