PROCESAMIENTO DE UNA MUESTRA DE ESPUTO


1. OBJETIVO
Identificar los microorganismos patogenos presentes en una muestra de esputo.


2. FUNDAMENTO

El esputo es una materia procedente de los pulmones y de los bronquios que se obtiene a través de tos profunda o mediante un aspirado. Esta secreción con apariencia de moco puede llegar a infectarse, teñirse de células anormales que pueden llevar al diagnóstico de afecciones del tracto respiratorio inferior.

Conociendo las principales bacterias nativas de la orofaringe y las patógenas del tracto respiratorio procesaremos la muestra de tal manera que nos permita la identificación de los microorganismo que pueda contener. este proceso empieza con las tinciones, que nos proporcionaran información sobre la morfología y características de la pared bacteriana, así descartaremos los microorganismos que no correspondan a esta información, acto seguido inoculamos en los medios y en las condiciones adecuadas que nos permitan el cultivo y aislamiento de las bacterias patógenas, observamos las características macroscópicas del crecimiento bacteriano que según el microorganismo será diferente en cada medio, volvemos a realizar tinciones y observar al microscopio este resultado será la base para realizar las correspondientes pruebas bioquímicas mediante las cuales podremos identificar presuntivamente al microorganismo problema para luego confirmarlo a través de pruebas más complejas.



3. PROCEDIMIENTO

Pasos para la obtención de esputo espontaneo:

· La muestra se obtendrá preferiblemente a primera hora de la mañana y con el paciente en ayunas.

· Lavarse los dientes y enjuagarse la boca

· Sentado obtener con golpe de tos la muestra mediante una expectoración profunda.la muestra debe provenir de las vías del tracto inferior no de la garganta o urofaringe

· El esputo obtenido tiene que ser espeso, no saliva.

· La muestra obtenida se recoge en un recipiente estéril de boca ancha.

Una vez se obtiene la muestra procedemos a:

·Analizar un frotis de esputo, observando la muestra en fresco en el microscopio, para detectar la presencia de células epiteliales, leucocitos…

·Luego sembramos con técnicas de aislamiento en los medios de cultivo adecuados para los posibles microorganismos presentes en la muestra.

Al estar trabajando con esputo de ante mano podemos sospechar de la presencia de los siguientes microorganismos:


Microorganismos nativos de la
orofaringe:

Bacterias anaerobias:
Bacterias y hongos patógenos:



Streptococcus (alfa hemolítico)
Micrococus spp.
Staphylococcus ssp. Coagulasa negativa
Difteroides
Neisseria spp.. (saprofitas)
Actinomices spp.

Bacteroides spp
Fusobacterium spp
Veillonella spp
Borrelia spp
Treponema denticola y T. refringens
Mycoplasma spp.

Estreptococcus pneumoniae

Streptococcus pyogenes
Staphylococcus aureus
Haemophilus parainfluenzae

Klebsiella pneumonia
Mycobacterium tuberculosis

Candida albicans





A partir de estos datos utilizamos los siguientes medios de cultivo para los siguientes microorganismos:





Medio de cultivo


Características


Microorganismo utilizado


Columbia ANC + 5% sangre de cordero- Agar

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Medio selectivo que se emplea para el aislamiento de microorganismo Gram+.


Ø
Neumococos
Ø
Estreptococos
Ø
Anaerobios

Agar nutritivo
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Medio general usado para el crecimiento de bacteria y algunos hongos.


Ø
Cándida albicans
Ø
Micobacterias

Chapman

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Medio selectivo para aislamiento de Staphylococos. Contiene manitol y rojo fenol que ayuda a la identificación presuntiva de Staphylococos aureus


Ø
Staphylococos

Brain-heart infusión Agar(B.H.I.A)
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Sirve para aislamiento y cultivo de microorganismos exigentes y en general lo que necesitan sangre para su crecimiento.


Ø
Aspergillus

Mac Conkey

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Medio selectivo para microorganismos Gram- y diferencial para microorganismo que fermentan la lactosa.


Ø
Enterobacterias

Agar chocolate Haemophilus 2


Medio de aislamiento para cepas exigentes, compuesto por una base nutritiva de factor X y hemoglobina.


Ø
Haemophilus influenzae
Ø
Neisseria





· A partir del crecimiento bacteriano en los medios de cultivo, realizamos frotis con las colonias aisladas. Para posteriormente realizarle la tinción de Gram. Observamos morfología y composición de la pared bacteriana.


Cocos
Bacilos

Gram+
Gram-
Gram+
Gram-
Estreptococos pneumoniae
X



Estreptococos b-hemoliticos

X


Candida albicans
HONGO
Micobacterias


ACIDO ALCOHOL-RESISTENTE
Staphylococus aureus
X



Asperguillus
HONGO
Enterobacterias



X



·
Sospechamos de la presencia de Micobacterias por lo que hacemos una tinción de Ziehl-Neelsen "ácido alcohol resistente", para detectarlas.

·A partir de los resultados de las tinciones, procedemos a realizar las respectivas pruebas bioquímicas de catalasa y oxidasa para confirmar o descartar la existencia de cada microorganismo y en particular para diferenciar entre las especies microbianas Estreptococos pneumoniae y Staphylococus aureus, pues morfológicamente son iguales y ya que ambos pueden estar en la muestra, podemos diferenciarles gracias a estas pruebas. Los resultados de estas pruebas son…



OXIDASA
CATALASA
Estreptococos pneumoniae
-
+
Estreptococos b-hemoliticos

+
Micobacterias

+
Staphylococus aureus
-
+
Enterobacterias
-
+


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· Una vez conocida la existencia de un microorganismo perteneciente a la familia de los Staphylococus procederemos a confirmar la existencia de la especie en particular del microorganismo Staphylococus aureus, por medio de la prueba Coagulasa, pues esta, se trata de una prueba que nos permite diferenciar a especies del género Staphylococus.
Tras observar dicha prueba podemos confirmar que se trata del microorganismo Staphylococus aureus pues su resultado ha sido positivo (se ha formado coágulo) y siendo este el único microorganismo de dicha especie que lo hace.

· Por último nos falta determinar ante qué clase de Enterobacteria nos encontramos. Para ello hemos utilizado la prueba bioquímica simultánea K.I.A, prueba exclusivamente para la determinación de especias pertenecientes la familia Enterobacteriocae.
Trascurridas 24h observamos que el tubo de K.I.A se ha quedado totalmente amarillo lo que significa una producción de ácido en todo el tubo apreciando también en la parte inferior un precipitado negro, lo que nos indica una clara producción de ácido sulfhídrico. Todo ello se resume en la sigla A/ASH2(identificativa de la Klebsiella pneumoniae) además de haber crecido en un medio específico para enterobacterias y haber dado los resultados de oxidasa(-) y catalasa(+).

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4. CONCLUSIÓN

Una vez realizadas las pruebas morfológicas y bioquímicas podemos concluir que los microorganismo contenidos en nuestra muestra problema son: micobacterias ,Staphylococus aureu y Klebsiella pneumoniae. Todos ellos causantes de la pneumonía.